Микробиологические свойства и биоактивность ферментированного навозного продукта (препарата 500) используемого в биодинамическом земледелии

Выдержки из статьи, опубликованной в Журнале «Microbiology and Biotechnology», 2013, 23(5), 644–651 http://dx.doi.org/10.4014/jmb.1212.12004

Авторы: Giannattasio, Matteo¹, Elena Vendramin¹, Flavio Fornasier², Sara Alberghini¹, Marina Zanardo¹, Fabio Stellin¹,Giuseppe Concheri¹, Piergiorgio Stevanato¹, Andrea Ertani¹, Serenella Nardi¹, Valeria Rizzi³, Pietro Piffanelli³, Riccardo Spaccini⁴, Pierluigi Mazzei⁵, Alessandro Piccolo⁵, and Andrea Squartini¹*

¹ Отделение агрономии Университета в Падуе, Италия
² Совет по исследованиям в сельском хозяйстве, Центр по изучению связей между растеними и почвой, Гориция, Италия

³ Технологический Парк Общества Падано, Лоди, Италия

⁴ Департамент почв, растений, окружающей среды и продукции животноводства (DiSSPAPA), Университета Федерико Наполеона II, Портичи, Италия

⁵ Междисциплинарный исследовательский центр спектроскопии ЯМР (CERMANU), Портичи, Италия

Ферментированное производное навоза, известное как Препарат 500 традиционно используется в качестве полевого опрыскивания в биодинамическом сельском хозяйстве для поддержания и повышения плодородия почвы. Эта работа была направлена на характеристику продукта с микробиологической точки зрения и анализ его биологически активных свойств. Подход включал молекулярно-таксономическую характеристику культивируемого микробного сообщества; отпечатки общего количества бактерий и грибковых сообществ; химический элементный анализ макроэлементов с помощью анализатора горения; анализ активности для шести ключевых ферментов; биотесты для определения представительства бактерий и производства хитолипоолигосахаридов; и растительная гормоноподобная активность. Было обнаружено, что в этом материале содержится бактериальное сообщество 2,38 × 108 КОЕ/г, в котором преобладают грампозитивы с незначительными экземплярами актинобактерий и Гаммапротеобактерии. Метод ARISA показал согласованность бактериальных сообществ в разных партиях препаратов одного и того же года, несмотря на географическое происхождение. Ферментативная активность показала повышенные значения β-глюкозидазы, щелочной фосфатазы, хитиназы и эстеразы. Препарат не обнаружил сигнала кворума и не показал индуцирующих генов ризобиального свойства, но проявлял сильный ауксиноподобный эффект на растения. Ферментативный анализ показал наличие биоактивного потенциала в контексте фертильности и круговорота питательных веществ. Активность IAA и продукты микробной деградации квалифицируются как возможная активность в качестве почвенных биостимуляторов. Обсуждаются количественные детали и возможные способы действия.

Биодинамическое (БД) сельское хозяйство - это форма органического земледелия. В дополнение к обычным методам органического земледелия, таким как почвообразование, компостирование и севообороты, использует два характерных препарата в качестве полевых опрыскивателей (называемых 500 и 501) и препаратов для компостирования навоза [15, 30]. Такие продукты включены в перечень материалов и технологий, разрешенных в органическом земледелии Регламентом ЕС (834/2007).

Препарат БД 500 представляет собой ферментированное производное коровьего навоза, используемое для повышения плодородия почвы и формирования сильной корневой системы, химические особенности которой ранее были описаны нашей группой [26]. Результатами долгосрочных полевых испытаний, наподобие тех, которые публикуются в научной работе Мадера и соавт. [17] доказано, что биодинамические практики, которые в первую очередь используют препарат 500, улучшают качество почвы; в частности, параметры например, органического вещества и микробной биомассы и разнообразия, были значительно выше в системах биодинамического земледелия по сравнению с обычными параметрами в органическом земледелии [16, 17]. Поскольку разница между органическим и БД земледелием заключается в основном в использовании определенных распыляемых соединений, таких как 500 и 501, основу для его воздействия можно искать в особенностях этих препаратов.

Кратковременные полевые испытания показали, что применение обоих препаратов коррелирует с более высоким урожаем чечевицы на единицу растительной биомассы, более низкое содержание углерода в зерне и сыром белке, большее содержание NO3 - в мягких сортах белой яровой пшеницы и большее содержание NH4+ в почве [6]. Было также установлено, что их применение связано с более высоким уровнем минерального углерода, который считается показателем микробиологически доступного С [8], и различиями в профилях жирных кислот почвенных микробов в первые два года исследований [7].

Недавно при исследовании молекулярного состава препарата 500 методом как твердотельной ядерно-магнитной резонансной (ЯМР) спектроскопии, так и термохимиолиза обнаружилось, что продукт обогащен биолабильными компонентами по сравнению с исходным навозом, что потенциально способствует биостимуляции микроорганизмов и растений.[26]. По сравнению с исходным навозом более ранние сообщения предполагали, что препарат 500 имеет более низкие значения рН, дыхания CO2 и соотношения C:N, более высокое содержание нитратов и меньшие потери органического вещества [3]. Целью настоящей работы было выполнение микробиологической характеристики препарата 500 и выделение некоторых параметров из его биологической активности. Предполагается, что эти результаты, наряду с результатами недавно оцененных молекулярных свойств, будут способствовать более четкому пониманию его способов действия в сельскохозяйственных системах.

Препарат 500

Были изучены различные коммерческие образцы препарата BD 500 от трех ведущих итальянских производителей. Образцы были получены “Società Agricola Biodinamica” (Labico, Рим), “La Farnia” (Rolo, Реджо-Эмилия) и “Biodynamic Agriculture Section” (Bolzano).

Вкратце, рутинное производство включает в себя следующую процедуру: в начале осени полые коровьи рога заполняются коровьим навозом из органического земледелия и закапываются под биодинамически обработанную почву. Органический материал оставляют разлагаться в течение зимы и коровьи рога вытаскиваются следующей весной после почти 150-180 дней созревания. Материал, извлеченный из коровьих рогов, умеренно влажный, темный, без запаха и похож на гумус.

Анализы включали три препарата 2010 года (Рим, Больцано и Реджо-Эмилия), один препарат 2011 года (Рим) и навоз этого же происхождения (произведенный в 2010 году).

…

Значения трех образцов препарата 500 из различных биодинамических хозяйств были довольно постоянными и индивидуализировали отношение C/N примерно на уровне 10. Исходный навоз перед упаковкой и закладкой показал более высокое содержание углерода. Это свидетельствует о ферментативном процессе, ведущем к улетучиванию С без потери азота, что предполагает ассимиляцию минерализованного N микробной биомассой.

…

Препарат 500 проявляет высокий специфический уровень активности, особенно в таких деструктивных состояниях, как β-глюкозидаза, в том числе для сложных полимеров (хитиназа). Высокая активность щелочной фосфатазы указывает на ее способность гидролизовать органические Р-эфиры. Препарат 500 обладает относительно низкой активностью лейцинаминопептидазы, которая является ферментом, участвующим в круговороте азота. Активность этого фермента, в отличие от этого, наиболее высока в фекалиях шелкопряда, из которых обычно выделяется жгучий запах аммиака, что согласуется с высокой скоростью распада аминокислот.

В этом ферментативном тесте два продукта отходов животных (Препарат 500 и фекалии шелкопряда) сравнивали с серией почв, включающих биодинамическую ферму, ряд обычных почв и почвы естественных сред. Непаханые почвы показали хороший уровень активности по сравнению с сельскохозяйственными. Препарат 500 демонстрировал высокие уровни активности, которые находились в том же диапазоне (арилсульфатаза и щелочная фосфомоноэстераза) или значительно выше, чем у необработанных почв (рис. 4). В целом можно было бы заметить, что традиционно возделываемые системы реагируют более высокой активностью при поступлении органических веществ, как это показано на удобренной навозом кукурузе. В этом отношении методы органического земледелия в сочетании с биоактивными стимуляторами, такими как Препарат 500, возможно, могли бы способствовать восстановлению баланса до значений, более близких к значениям естественного состояния. Последние обычно имеют более интенсивный углеродный цикл, гарантирующий эффективный биологический оборот, а круговорот азота способствует устойчивому плодородию.

…

Гормоноподобная активность Растений

Препарат определяется как обладающий биостимулирующей активностью, когда он производит эффекты, сравнимые с эффектами индол-3-уксусной кислоты (IAA) и гибберелловой кислоты, даже если фактические молекулы отсутствуют. При обработке 500 семян кресс-салата (Lepidium sativum L.) разведениями препарата 500 наблюдалась положительная ауксиноподобная активность, соответствующая 1 мг/мл = 0,03 промилле индолуксусной кислоты. Вместо этого, что касается ГА-подобной активности, то при исследовании роста 500 гипокотилей цикория (Cychorium intybus Л.), никаких эффектов не наблюдалось. Что касается ауксиноподобной активности, то концентрация, возникающая в суспензии, которая фактически используется в полевых условиях (200 г в 60 л на 1 га) находилась в том же диапазоне активности ИАА, что и некоторые известные коммерчески используемые биостимуляторы, такие как гидролизат люцерны [12] и лигносульфонат-гуматы [13]. Данные подтверждают возможность того, что активный гормоноподобный уровень активности доставляется посевам при опрыскивании препаратом 500.

Рис. 1. ARISA-сравнение количества бактерий и грибов препарата 500 с другими субстратами и почвой

ОБСУЖДЕНИЕ РАБОТЫ

Стремясь к общим соображениям о возможном действии в почве, можно указать на следующее. Препарат 500 в значительной степени наделен ферментативно-специфической активностью, богат микробными клетками, в культивируемой фракции которых преобладает род Bacillus, и проявляет ауксиноподобную активность. Наличие богатой микробной популяции согласуется с нашей параллельной детальной химической характеристикой [26], это подчеркивало доминирующее присутствие разветвленных алканов, происхождение которых признано микробным. Ауксин-подобная активность также согласуется с низким присутствием грибов, поскольку обилие лигниновых соединений, которые являются хорошими кандидатами на IAA-подобную активность, вероятно, связано с ограниченным действием деградирующих лигнин грибов. Подобно гуминовым материалам, полученным из зеленого компоста или вермикомпоста, большое количество недеградированных остатков лигнина, обнаруженных в препарате 500 Спаччини и др. (Spaccini et al.) [26], может объяснять биостимуляцию по отношению к микробам и растениям. Фактически, несколько исследований показали, что гуминовые экстракты из компоста оказывают физиологическое воздействие на растения аналогично ауксиновым гормонам [4, 11] . Более того, не исключено, что большое содержание углеводов и пептидов в препарате 500 [26] может включать микробную пролиферацию и, следовательно, большую ризосферную активность [5].

Сообщается, что препарат 500 повышает биологическую активность почвы и стимулирует корнеобразование [15, 30], несмотря на то, что его применение осуществляется в очень малых количествах. Сельскохозяйственный протокол в биодинамике предписывает распыление около 200 г препарата 500 в 60-70 л воды и распределение по гектару почвы. При внесении 200 г такого соединения на целый гектар следует сначала рассмотреть, в каком объеме раствора оно окажется. Вес гектара земли, считая глубину от нуля до 20 см полезной для корней, составляет около 2000 тонн. Вода в почве в среднем составляет четверть ее веса и, следовательно, составляет 500 тонн, т. е., 500 000 л. Если 200 г этого соединения растворить в конечном объеме 500 000 л, то достигается концентрация 0,0004 г на литр. Молекула с низкой молекулярной массой (например, 250), 1 М раствора которой составляет 250 г/л, будет таким образом разбавлена до 2,5 мкм. Эта концентрация в микромолярном диапазоне определенно должна рассматриваться как очень высокая с точки зрения биологической активности. Существует много свидетельств о спектре активности соединений микробного происхождения, которые эффективны в инициировании физиологических изменений растений и реорганизации морфогенеза. Например, хитолипоолигосахариды, индуцирующие клубенькование бобовых, начинают свою активность в концентрациях до 0,1 наномоляра (10-10 М) [10]. Кроме того, в биологии есть несколько примеров молекул, активных даже при фемтомолярных концентрациях (10-15 М). Следовательно, предполагая, что 200 г препарата 500, очевидно, не состоит из чистого активного вещества, даже если активные начала в нем были ниже 1/10 000-й его массы, они уже будут доставлены в концентрации 10-10 М. Поэтому неудивительно, что распределение из предписанных доз полностью способно приносить в почву диапазоны молекулярных сигналов, которые хорошо укладываются в ожидаемые окна их биологической активности.

Поэтому маловероятно, что в используемой дозе этот продукт эффективен в качестве структурного органического удобрения или микробного инокулянта видов биоудобрений [31], тогда как нельзя исключать, что он может действовать через регуляцию почвенных бактерий. Бактерии обнаруживают и реагируют на чрезвычайно низкие уровни сигнальных молекул в окружающей их среде, как показано в работе по кворумному зондированию [19]. Было показано, что многие высшие растения продуцируют сигнально-имитирующие соединения, тем самым влияя на соотношение плотности бактерий [2]. Потенциально биологически активные соединения могут быть в изобилии использованы при приготовлении 500 (например, низкомолекулярные пептиды), благодаря его микробно-опосредованному медленному созреванию в условиях низкого содержания кислорода и последующей протеолитической активности. Это напоминает ситуацию, наблюдаемую при наращивании биостимулирующего потенциала, о которой сообщалось в других исследованиях, когда, начиная с очень разных субстратов, как только они трансформируются через переваривание субтилизина, возникает замечательная способность растений усиливать рост [28].

Другим возможным способом действия Препарата 500, который не исключает первого, может быть гормональное влияние на рост и развитие сельскохозяйственных культур. Деффун и Сколфилд [9] обнаружили, что гуминовые кислоты, экстрагированные из этого и других БД препаратов (505 и 507), вызывают положительную реакцию роста проростков пшеницы по сравнению с контролем, причем препараты БД и ИАА эффективны при концентрациях 0,2 × 10^-11 и ниже. Сообщалось также, что препарат 500 обладает высокой цитокининовой активностью [27] и, как мы показали в настоящей работе, эффективной ауксиновой активностью. Таким образом, способ действия продукта может быть предположительно стимулирующим образование корней и, следовательно, активирующим растения, чтобы получить доступ к почвенным запасам питательных соединений, которые в противном случае были бы упущены и не использованы. Это предположение согласуется с рекомендуемой практикой биодинамического земледелия, которая предписывает, чтобы Препарат 500 был эффективным - наличие запаса органического вещества в почве. Следует также учитывать, что ауксин, как сообщалось, стимулирует рост бактерий [29], и поэтому его эффекты могут быть частично опосредованы микроорганизмами, а не действовать непосредственно на растения.

В настоящее время проводятся эксперименты по оценке дальнейших аспектов Препарата 500, такой как сукцессионное созревание всего его бактериального сообщества, которое будет определяться метагеномными подходами, запускаемыми на образцах с возрастающими уровнями созревания. Эти тесты прольют дополнительный свет на биологические особенности этого биодинамического продукта.

Литература

1. Audus, L. J. 1972. Plant Growth Substances, Vol. 1. Leonard Hill, London.

2. Brelles-Marino, C. and E. J. Bedmar. 2001. Detection, purification and characterization of quorum-sensing signal molecules in plant-associated bacteria. J. Biotechnol. 91: 197-209.

3. Brinton, W. F. 1997. Dynamic chemical processes underlying BD horn manure (500) preparation. J. Biodynamics 214: 1-8.

4. Canellas, L. P., L. B. Dobbss, A. L. Oliveira, J. G. Chagasa, N. O. Aguiar, V. M. Rumjanek, et al. 2012. Chemical properties of humic matter as related to induction of plant lateral roots. Eur. J. Soil Sci. 63: 315-324.

5. Canellas, L. P., A. Piccolo, L. B. Dobbss, R. Spaccini, F. L. Olivares, D. B. Zandonadi, and A. R. Faзanha. 2010. Chemical composition and bioactivity properties of size-fractions separated from a vermicompost humic acid. Chemosphere 78: 457-466.

6. Carpenter-Boggs, L., J. P. Reganold, and A. C. Kennedy. 2000. Biodynamic preparations: Short-term effects on crops, soils, and weed populations. Am. J. Altern. Agric. 15: 96-114.

7. Carpenter-Boggs, L., J. P. Reganold, and A. C. Kennedy. 2000. Organic and biodynamic management: Effects on soil biology. Soil Sci. Soc. Am. J. 64: 1651-1659.

8. Davidson, E. A., L. F. Galloway, and M. K. Strand. 1987. Assessing available carbon: Comparison of techniques across selected forest soils. Commun. Soil Sci. Plant Anal. 18: 45-64.

9. Deffune, G. and A. M. Scolfied. 1995. Effects of humic acids and three bio-dynamic preparations on the growth of wheat seedlings. Proc. 3rd ESA Congress, Abano-Podova, Paper Ref No. 3-56.

10. D’Haeze, W. P., P. Mergaert, J. C. Promй, and M. Holsters. 2000. Nod factor requirements for efficient stem and root nodulation of the tropical legume Sesbania rostrata. J. Biol. Chem. 275: 15676-15684.

11. Dobbs, L. B., L. P. Canellas, F. L. Olivares, N. O. Aguiar, L. E. Pereira Peres, M. Azevedo, et al. 2010. Bioactivity of chemically transformed humic matter from vermicompost on plant root growth. J. Chem. 58: 3681-3688.

12. Ertani, A., M. Schiavon, A. Muscolo, and S. Nardi. 2013. Alfalfa plant-derived biostimulant stimulate short-term growth of salt stressed Zea mays L. plants. Plant Soil 364: 145.

13. Ertani, A., O. Francioso, V. Tugnoli, V. Righi, and S. Nardi. 2011. Effect of commercial lignosulfonate-humate on Zea mays L. metabolism. J. Agric. Food Chem. 59: 11940-11948.

14. Fornasier, F. and A. Margon. 2007. Bovine serum albumin and Triton X-100 greatly increase phosphomonoesterases and arylsulphatase extraction yield from soil. Soil Biol. Biochem. 39: 2682-2684.

15. Koepf, H. H., B. B. Pettersson, and W. Schaumann. 1976. Biodynamic Agriculture. The Anthroposophic Press, Spring Valley, New York.

16. Mаder, P., L. Pfiffner, A. FlieЯbach, and U. Niggli. 1995. Biodiversity of soil biota in biodynamic, organic and conventional farming systems, pp. 45-57. In J. Isart and J. J. Llerena (eds.). Biodiversity and Land Use: The Role of Organic Farming. Bonn.

17. Mader, P., A. Fliessbach, D. Dubois, L. Gunst, P. Fried, and U. Niggli. 2002. Soil fertility and biodiversity in organic farming. Science 296: 1694-1697.

18. Marchesi, J. R., T. Sato, A. J. Weightman, T. A. Martin, J. C. Fry, S. J. Hiom, and W. G. Wade. 1998. Design and evaluation of useful bacterium-specific PCR primers that amplify genes coding for bacterial 16S rRNA. Appl. Environ. Microbiol. 64: 795-799.

19. Miller, M. B. and B. L. Bassler. 2001. Quorum sensing in bacteria. Annu. Rev. Microbiol. 55: 165-199.

20. Nannipieri, P., J. Ascher, M. T. Ceccherini, L. Landi, G. Pietramellara, and G. Renella. 2003. Microbial diversity and soil functions. Eur. J. Soil Sci. 54: 655-670.

21. Nardi, S., G. Concheri, and G. Dell’Agnola. 1996. Biological activity of humus, pp. 361-406. In A. Piccolo (ed.). Humic Substances in Terrestrial Ecosystems. Elsevier, New York.

22. Osborn, A. M., E. R. B. Moore, and K. N. Timmis. 2000. An evaluation of terminal-restriction fragment length polymorphism (T-RFLP) analysis for the study of microbial community structure and dynamics. Environ. Microbiol. 2: 39-50.

23. Rossen, L., C. A. Shearman, A. W. B. Johnston, and J. A. Downie. 1985. The nodD gene of Rhizobium leguminosarum is autoregulatory and in the presence of plant exudate induces the nodABC genes. EMBO J. 4: 3369-3373.

24. Russo, R. O. and G. P. Berlyn. 1990. The use of organic biostimulants to help low input sustainable agriculture. J. Sustain. Agric. 1: 19-42.

25. Shaw, P. D., P. Gao, S. L. Daly, C. Cha, J. E. Cronan Jr., K. L. Rinehart, and S. K. Farrand. 1997. Detecting and characterizing N-acyl-homoserine lactone signal molecules by thin-layer

chromatography Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 6036-6041.

26. Spaccini, R., P. Mazzei, A. Squartini, M. Giannattasio, and A. Piccolo. 2012. Molecular properties of a fermented manure preparation used as field spray in biodynamic agriculture. Environ. Sci. Pollut. Res. Int. 19: 4214-4225.

27. Stearn, W. C. 1976. Effectiveness of two biodynamic preparations on higher plants and possible mechanism s for the observed response. M.S. Thesis, Ohio State Univ., Columbus, OH.

28. Tejada, M., C. Benнtez, I. Gуmez, and J. Parrado. 2011. Use of biostimulants on soil restoration: Effects on soil biochemical properties and microbial community. Appl. Soil Ecol. 49: 11- 17.

29. Tsavkelova, E. A., T. A. Cherdyntseva, S. Y. Klimova, A. I. Shestakov, S. G. Botina, and A. I. Netrusov. 2007. Orchidassociated bacteria produce indole-3-acetic acid, promote seed germination, and increase their microbial yield in response to exogenous auxin. Arch. Microbiol. 188: 655-664.

30. Turinek, M., S. Grobelnik-Mlakar, M. Bavec, and F. Bavec. 2009. Biodynamic agriculture research progress and priorities. Renew. Agricult. Food Syst. 24: 146-154.

31. Vessey, K. J. 2003. Plant growh promoting rhizobacteria as biofertilizers. Plant Soil 255: 571-586.

Перевод с англт С. Тужилина